一、基本原理
不同帶電顆粒，因其所帶電荷的性質(zhì)和多少、形狀和大小等差異，使其在同一電場(chǎng)強(qiáng)度、相同的支持介質(zhì)和緩沖液的條件下，各自的泳動(dòng)速度不同，從而使各種不同的帶電顆粒如
蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子得以分離。帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度以遷移率(mobility)表示。故遷移率可定義為帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度，是指在1V／m的電場(chǎng)作用下，帶電顆粒每鐘移動(dòng)的距離(m)，其移動(dòng)速率為m／s，遷移率以m2／(V·s)表示。而在實(shí)際應(yīng)用中以cm2／(V·s)表示，因此通過測(cè)量d、l、V、t，便可計(jì)算遷移率。
二、影響顆粒電泳速度的因素
1．測(cè)試樣品
(1)電荷
在電場(chǎng)中，帶電顆粒向各自相反方向的電泳動(dòng)。若同時(shí)帶有正、負(fù)兩種電荷,其移動(dòng)方向取決于凈電荷，其遷移率與凈電荷的大小成正比。大部分生物大分子如蛋白質(zhì)都帶有陰離子和陽離子基因，是典型的兩性電解質(zhì)。帶電的性質(zhì)和多少取決于該物質(zhì)的pKa、溶液的pH值及離子強(qiáng)度。
(2)顆粒大小、形狀和分子量
大的球形分子，在固相或凝膠穩(wěn)定的基質(zhì)中，在非常稀的溶液中，其遷移率與球的半徑成反比。而分子量小于5000的肽類或離子，其遷移率與顆粒半徑的平方成反比，或與其分子量的2／3次方成反比。其遷移率與顆粒凈電荷和分子大小的關(guān)系,同樣大小的分子，因其形狀不同，如纖維蛋白與球蛋白，在電泳時(shí)，與周圍介質(zhì)的磨擦力和靜電力不同，遷移率也不同。
2．電場(chǎng)強(qiáng)度
電場(chǎng)強(qiáng)度是指每1厘米的電位降，故又稱電位梯度，以V／cm表示。電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)泳動(dòng)速度起決定性作用。在一定范圍內(nèi)，電場(chǎng)強(qiáng)度愈高，帶電顆粒泳動(dòng)愈快，根據(jù)不同電泳所需電場(chǎng)強(qiáng)度，可分為常壓電泳和高壓電泳。常壓電泳一般在100～500V，高壓電泳一般為500～10000V。紙電泳、醋酸纖維電泳、聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠電泳只需200～500V,而固相pH值梯度等電聚焦電泳則需要3000～5000V高壓。電壓與支持介質(zhì)的長(zhǎng)度有關(guān)，而電流與支持介質(zhì)的橫截面(或?qū)挾?成正比。大部分電泳用恒壓控制電場(chǎng)強(qiáng)度。在做管狀圓盤電泳時(shí)，一般用調(diào)節(jié)每管的電流(mA)控制電場(chǎng)強(qiáng)度，在電泳過程中，保持穩(wěn)定的電場(chǎng)強(qiáng)度或穩(wěn)定的電流，是電泳成功與否的重要條件。
3．緩沖液
(1)pH值
溶液的pH值直接影響帶電顆粒的解離程度，并決定其所帶凈電荷的性質(zhì)和多少。氨基酸、蛋白質(zhì)均為可解離的兩性分子，pH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，則顆粒所帶的凈電荷越多，泳動(dòng)速度愈快。當(dāng)在某一pH值時(shí)，蛋白質(zhì)分子所帶的正電荷數(shù)恰好等于負(fù)電荷數(shù)，即凈電荷等于零時(shí)，蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中不移動(dòng)。此時(shí)溶液的pH值，即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。因此，在分離蛋白質(zhì)混合物時(shí)，應(yīng)選擇合適的pH值，使各種蛋白質(zhì)所帶的電荷差異較大而彼此分開。在電泳過程中，為了使溶液的pH值保持恒定，必須選用緩沖溶液。
(2)離子強(qiáng)度
離子強(qiáng)度高，遷移率小，反之則大。但離子強(qiáng)度過低時(shí)，遷移率反而會(huì)因?qū)щ姸鹊慕档投鴾p少，一般適宜的離子強(qiáng)度為0.02～0.20。緩沖液離子強(qiáng)度的選擇，取決于待測(cè)樣品的組分。其緩沖作用應(yīng)在整個(gè)電泳過程使pH值保持恒定。當(dāng)增加離子強(qiáng)度時(shí)，使分離得到的蛋白區(qū)帶更窄或斑點(diǎn)更為集中。
4．溶液的溫度和黏度
因溶液的黏度與溫度有關(guān)，故溫度間接影響電泳遷移率。在0～5℃時(shí)，溫度升高l℃，水的黏度下降約3％，而在室溫時(shí)，溫度的改變對(duì)黏度影響較小。因此遷移率隨溫度的升高而增加。當(dāng)電流通過支持介質(zhì)和緩沖液時(shí)，會(huì)放出大量的熱量，而熱量隨電壓和離子強(qiáng)度的增加而加大，當(dāng)熱量增至一定程度時(shí)，其產(chǎn)生的溫度梯度在電泳槽中會(huì)導(dǎo)致分離區(qū)帶失真，故在使用高壓和高離子強(qiáng)度緩沖液電泳時(shí)，必須使用冷卻裝置。
5．電內(nèi)滲
在電場(chǎng)作用下，液體對(duì)于固體支持介質(zhì)的相對(duì)移動(dòng)稱電內(nèi)滲(eletroendosmosis，EEO)。由于固體支持介質(zhì)吸附水中的正或負(fù)離子，使溶液帶電，在電場(chǎng)下，溶液就向一定的方向移動(dòng)，產(chǎn)生電滲現(xiàn)象。
如在紙電泳中，濾紙吸附羥基使表面帶負(fù)電荷，而與紙接觸的水溶液帶正電荷，此時(shí)液體便向負(fù)移動(dòng)，并攜帶顆粒(包括中性顆粒)同時(shí)移動(dòng)，故在電泳時(shí)顆粒泳動(dòng)的表面速度是顆粒本身的電泳速度與由于水溶液移動(dòng)產(chǎn)生的電滲速度的矢量和。當(dāng)電內(nèi)滲向負(fù)移動(dòng)時(shí)，帶正電的顆粒也向負(fù)移動(dòng)，則其表觀移動(dòng)速度將比電泳速度快，若顆粒原向正移動(dòng)，則表觀速度將比電泳速度慢。為校正這一誤差，可用中性物質(zhì)如葡聚糖、糊精與樣品同時(shí)做電泳，然后將中性物質(zhì)的移動(dòng)距離扣除后再測(cè)量泳動(dòng)距離。
電內(nèi)滲因支持介質(zhì)表面帶電基團(tuán)的多少而異，在瓊脂糖凝膠中，能看到較明顯的電內(nèi)滲現(xiàn)象，而在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，電內(nèi)滲現(xiàn)象可以忽略不計(jì)。因此，在做大分子物質(zhì)等電聚焦時(shí)，必須使用電內(nèi)滲很小的瓊脂糖，電內(nèi)滲大的瓊脂糖會(huì)使pH值梯度向陰漂移，得不到正確的等電點(diǎn)。sjgma試劑手冊(cè)在瓊脂糖規(guī)格中均標(biāo)出電內(nèi)滲(EEO)值，應(yīng)根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求選用不同規(guī)格的瓊脂糖。
6．分子篩效應(yīng)
在不同濃度和交聯(lián)度的凝膠中，其孔徑大小不同，通過分子篩效應(yīng)可將不同大小的顆粒進(jìn)行分離，其分離機(jī)制是小分子通過凝膠微孔，而大分子顆粒難通過微孔而使遷移阻滯，從而將被分離的顆粒，按分子大小的順序排列進(jìn)行分離。
客服一
