做免疫組化時(shí)，般都會(huì)封閉。以減少假陽(yáng)性。
封閉主要是用于封去切片上些非特異性吸附。用種非特異性的
蛋白，把那些容易吸附蛋白的空間和位點(diǎn)占起來，這樣，加上
抗體時(shí)，抗體只能與對(duì)應(yīng)的抗原去結(jié)合了。
般封閉可以用5%的BSA，這個(gè)價(jià)格便宜，而且效果還行。但理論上，用與二抗同來源的正常血清會(huì)更好。
比如，抗為國(guó)產(chǎn)的兔抗IL-2，二抗用標(biāo)記的羊抗兔IgG。那么，封閉血清就選擇與二抗同來源的正常羊血清（般為山羊）。而同理，如果抗為羊抗IL-2，二抗可以選標(biāo)記的兔抗羊IgG，封閉血清選擇正常兔血清。
使用時(shí)，可以用PBS將正常血清稀釋20倍，直接滴加在切片上，37℃度10-30分鐘，直接甩掉，不洗，輕輕的吸下旁邊的液體，再加抗。聽說4℃過夜比起37℃兩小時(shí)背景會(huì)干凈些。當(dāng)然，時(shí)間也會(huì)長(zhǎng)些。
免疫組化中的血清封閉原理
先加抗后再封閉的話，抗就會(huì)結(jié)合到固相表面上，這種結(jié)合力是非特異性的疏水作用力，這種作用力是比較強(qiáng)的，經(jīng)過處理的固相表面如硝酸纖維膜，酶標(biāo)板對(duì)蛋白的吸附力更強(qiáng)，你再去封閉就沒有作用了。
當(dāng)然，也不是說封閉蛋白就完全不會(huì)封閉掉抗的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，在蛋白過量的條件下，蛋白質(zhì)之間會(huì)有黏附和堆積作用，但這種作用通常是不穩(wěn)定的。
如果你所選擇的抗與固相抗原親和力較高，在適合的buffer條件下，抗會(huì)競(jìng)爭(zhēng)它的結(jié)合位點(diǎn)。蛋白質(zhì)之間那點(diǎn)黏附和堆積作用力當(dāng)然競(jìng)爭(zhēng)不過它啦。
" 組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽(yáng)性染色稱為非特異性背景染色，常見的原因是蛋白吸附于高電荷的膠元和結(jié)締組織成分上。有效方法是在用第抗體加制備第 二抗體動(dòng)物之非免疫血清(1:5~1:20) 封閉組織上帶電荷基團(tuán)而除去與第抗體非特異性結(jié)合。必要時(shí)可加入 2%~5% 牛血清蛋白，可進(jìn)步減少非特異性染色。作用時(shí)間為 10~20min。 也可用除制備第抗體以外的其它動(dòng)物血清 (非免疫的)。有明顯溶血的血清不能"
"對(duì)消除背景的非特異性染色有很好的效果。當(dāng)然使用特異性高、效價(jià)高的
第抗體是重要的條件。"
"抗原-抗體是免疫球蛋白分子上的抗原結(jié)合簇與抗原分子上的抗原決定簇相互吸引以及多種分子間的引力參與發(fā)生的。這種反應(yīng)沒有化學(xué)鍵的形成。抗原-抗體的結(jié)合是可逆的“
客服一
