如今，人們通常利用新一代測(cè)序（NGS）技術(shù)對(duì)cfDNA進(jìn)行高通量分析，看看哪些基因有突變，并根據(jù)突變信息來(lái)確定下一步的診療方案。從理論上說(shuō)，這是一種簡(jiǎn)單易懂的方法，不過(guò)，血清或血漿中的cfDNA濃度極低，這為測(cè)序文庫(kù)的制備帶來(lái)了挑戰(zhàn)。
血清或血漿中的游離DNA（cfDNA）正成為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（NIPT）或癌癥液體活檢的焦點(diǎn)。在癌癥檢測(cè)中，人們已發(fā)現(xiàn)癌癥患者的cfDNA數(shù)量和完整性與健康對(duì)照不同。這使得cfDNA有望成為癌癥診斷、預(yù)后和分層的生物標(biāo)志物。
如今，人們通常利用新一代測(cè)序（NGS）技術(shù)對(duì)cfDNA進(jìn)行高通量分析，看看哪些基因有突變，并根據(jù)突變信息來(lái)確定下一步的診療方案。從理論上說(shuō)，這是一種簡(jiǎn)單易懂的方法，不過(guò)，血清或血漿中的cfDNA濃度極低，這為測(cè)序文庫(kù)的制備帶來(lái)了挑戰(zhàn)。
為此，QIAGEN開(kāi)發(fā)出一種經(jīng)過(guò)優(yōu)化的文庫(kù)制備方案，融合了高效率的接頭連接和無(wú)偏向的文庫(kù)擴(kuò)增，可確保獲得高產(chǎn)量的優(yōu)質(zhì)測(cè)序文庫(kù)，而只需要1 ng cfDNA。制備出的文庫(kù)可與靶向富集技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)靈敏的突變檢測(cè)。
流程改進(jìn)
cfDNA有兩個(gè)明顯的特征：首先，濃度極低，通常1 ml血漿中只能提取出1-100 ng cfDNA；其次，血漿或血清中的循環(huán)DNA大多以短片段存在，在180 bp左右。根據(jù)這些特征，GeneRead Library Prep Kit的操作進(jìn)行了一些修改，省去了片段化的步驟。連接步驟中的接頭濃度有所降低，并使用Agencourt AMPure XP純化反應(yīng)，去除接頭二聚體。
當(dāng)然，在制備文庫(kù)之前，你要先從人類血清或血漿中純化出游離的DNA和RNA。很多文獻(xiàn)都采用了QIAGEN的QIAamp® Circulating Nucleic Acid Kit。它利用硅膠膜選擇性地結(jié)合目標(biāo)核酸，可從血漿、血清和其他無(wú)
細(xì)胞體液中高效純化游離核酸。樣品處理量可達(dá)5 ml，洗脫體積可在20–150 μl之間靈活選擇。
之后，利用10 μl cfDNA洗脫物，你就可以輕松地建庫(kù)了。整個(gè)流程大約在3小時(shí)內(nèi)完成，而手工操作時(shí)間不到30分鐘。首行末端修復(fù)，加A尾，再連接接頭。之后利用Agencourt AMPure XP純化反應(yīng)，去除接頭二聚體。接著是12個(gè)循環(huán)的文庫(kù)擴(kuò)增，純化后即可得到高質(zhì)量的NGS文庫(kù)啦。
單管操作
操作過(guò)程中需要使用到三個(gè)
試劑盒：GeneRead DNA Library I Core Kit、GeneRead Adapters以及GeneRead DNA I Amp Kit。這些試劑盒與Illumina的
儀器兼容。另外，QIAGEN也提供與Ion Torrent儀器兼容的試劑盒。不過(guò)，Agencourt AMPure XP磁珠需要單獨(dú)購(gòu)買。
GeneRead DNA Library I Core Kit包含末端修復(fù)、加A尾和連接所需的緩沖液和試劑。與其他的文庫(kù)制備流程相比，快速的單管操作只需較少的回收步驟，極大程度減少了手工操作可能帶來(lái)的污染和失誤風(fēng)險(xiǎn)，節(jié)省時(shí)間和人力。
GeneRead DNA I Amp Kit含有創(chuàng)新的高保真預(yù)混液，其中包含用于擴(kuò)增的GeneRead HiFi Polymerase。GeneRead HiFi Polymerase是獨(dú)特的、高度特異性的聚合酶，能夠準(zhǔn)確擴(kuò)增文庫(kù)DNA，錯(cuò)配率低，序列偏差小。在標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增中，若DNA序列的AT或GC含量高，則擴(kuò)增產(chǎn)物可能較少或沒(méi)有，導(dǎo)致錯(cuò)誤的序列數(shù)據(jù)或NGS測(cè)序結(jié)果。GeneRead HiFi Polymerase與預(yù)混液中獨(dú)特的配方共同作用，能夠確保均一擴(kuò)增GC含量高的基因組序列，以便在后續(xù)的測(cè)序?qū)嶒?yàn)中獲得準(zhǔn)確結(jié)果。
優(yōu)質(zhì)文庫(kù)
QIAGEN曾對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)幾乎100%的測(cè)序數(shù)據(jù)（reads）能定位到人類參考基因組，并且近100%是unique reads。高比例的unique reads代表了高的文庫(kù)轉(zhuǎn)換效率，也代表了文庫(kù)中高的序列多樣性。
這種cfDNA測(cè)序文庫(kù)與基于雜交的靶向富集相結(jié)合，也帶來(lái)了出色的覆蓋度。QIAGEN曾利用xGen® Pan-Cancer Panel，從文庫(kù)中富集127個(gè)突變基因。測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，超過(guò)99%的reads都以0.2X平均覆蓋度覆蓋，而超過(guò)90%的reads以0.5X平均覆蓋度覆蓋。不同位置的目標(biāo)區(qū)域也有著極其相似的平均覆蓋度。
這下，你信心大增了吧。通過(guò)GeneRead文庫(kù)制備的改良操作，即使是濃度極低的cfDNA，也能帶來(lái)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的文庫(kù)。
客服一
