從基因表達到RNA干擾，再到如今大熱的基因組編輯，它們都離不開一個前提：DNA或RNA分子能夠高效地導入
細胞內并發(fā)揮功能。然而，問題是，細胞并不想接收它們，而細胞膜也是一個可怕的屏障，它帶的是負電荷，核酸同樣帶負電荷。
不過，人類的智慧是無限的。人們已經設計出各種方法來繞過這一屏障，包括化學方法，利用帶正電的轉染試劑來中和帶負電的核酸；生物學方法，采用經過遺傳學改造的病毒將非病毒基因轉移至細胞內；以及物理方法，在細胞膜上開孔，將核酸直接送入細胞。
當然，各種細胞適用的轉染條件都可能不同，正所謂甲之蜜糖、乙之砒霜，并沒有一種放之四海而皆準的方法。因此，研究人員需要根據(jù)你的細胞類型和實驗要求來選擇理想的方法。何謂理想的方法？那就是轉染效率高、細胞毒性低、對正常生理的影響*小，并且簡單可重復。這看似挺難，好在Thermo Fisher（原Life Technologies）帶來了一個轉染的整體解決方案，可幫助你快速實現(xiàn)目標。
既高效又溫和的DNA轉染——Lipofectamine? 3000
對于DNA的轉染，大家往往在時間想到Lipofectamine? 2000。這種金招牌的陽離子脂質體試劑幾乎是人們的，目前引用文獻已經超過50,000篇。通過帶負電荷的核酸與帶正電荷的合成脂質體試劑之間的靜電作用，核酸-陽離子脂質體試劑復合物自發(fā)形成。細胞通過內吞作用攝取復合物，然后釋放至胞漿。一旦進入細胞，轉染DNA轉移至細胞核內，通過未知的機制表達。
之所以如此受歡迎，首先是因為它能夠高效轉染各種細胞系，幫助在各種實驗的步獲得漂亮的結果，其次也因為它對DNA和RNA皆有效，適合DNA和RNA的共轉染。不過，轉染效率和細胞毒性，正如硬幣的正反兩面。Lipofectamine 2000在獲得贊揚聲的同時，也收到毒性高的詬病。對于頑強的細胞系而言，這可能不是問題，但是嬌弱的原代細胞和干細胞卻折騰不起。
為此，Thermo Fisher的科學家優(yōu)化了轉染過程的四個步驟，并結合的脂質體納米微粒技術，開發(fā)出*新的Lipofectamine 3000試劑。它提供了出眾的轉染性能和可重復的結果，適用于各種難轉染的細胞和常見的細胞。由于轉染性能出眾，你在轉染過程中可減少試劑的用量，從而進一步降低潛在的毒性風險。
3000與2000相比，轉染效率如何？研究人員當然也進行了比較。他們使用這兩種試劑轉染來自各種組織的癌細胞。研究證實，Lipofectamine 3000試劑的轉染性能明顯高于2000。使用Lipofectamine 2000時，只有25%的癌癥細胞系被認為是容易轉染的（轉染效率高于50%），而使用Lipofectamine 3000，這個比例高達60%。里斯本大學的Rui Eduardo Castro博士在使用過Lipofectamine 3000后興奮地說道：“我們非常高興且驚訝地看到， 在難以轉染的細胞系中使用Lipofectamine 3000，可將轉染效率提高10倍，而且減少了細胞死亡率。結果真是太棒了！”
因此，即使是難轉染的細胞，使用Lipofectamine 3000也很容易獲得滿意的結果。還是有點不滿意？沒關系，Thermo Fisher建議你嘗試一下不同的DNA濃度和細胞密度。采用陽離子脂質體介導的轉染，轉染時貼壁細胞達到70-90%匯合，懸浮細胞達5 x 105至2 x 106個細胞/mL，可以獲得*佳的結果。還是不行？那就試試mRNA轉染吧。
mRNA也能高效轉染？當然！——Lipofectamine? MessengerMAX?
關于mRNA轉染，人們往往有多種誤解。有人認為，mRNA難以制備。其實，這方面的工具有很多，比如Thermo Fisher的mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra轉錄
試劑盒，就能制備20-40 ?μg即用型mRNA。還有人認為，mRNA不穩(wěn)定，容易降解。No，no！只要采取一些簡單的預防措施，就能確保mRNA穩(wěn)定：使用不含RNA酶的試劑和吸頭，分裝mRNA并置于-80?C保存。
與DNA轉染相比，mRNA轉染只需進入細胞質，而非細胞核，從而大大提高了有絲分裂后細胞或緩慢分裂細胞的轉染效率。這樣，利用Lipofectamine MessengerMAX轉染mRNA可以實現(xiàn)更快速的
蛋白質表達，在轉染細胞中達到更高的表達一致性，特別適合原代神經元、神經干細胞和永生化神經細胞。
在基因組編輯的應用中，Lipofectamine MessengerMAX試劑通過高效轉染提高了GeneArt? CRISPR核酸酶mRNA的剪切和重組效率，可以大大提高基因修飾的效率并簡化下游過程。此外，mRNA不會入核，這下老板再也不用擔心基因組整合的風險了。
也許你會擔心，操作起來一定很復雜吧。其實，只要制備好了mRNA，轉染的基本步驟與DNA相同，不外乎是稀釋、孵育這些，難不倒諸位高手。況且還可以購買陽性對照GFP mRNA同時轉一下，效果好不好，一看就知道。
CRISPR好幫手——Lipofectamine? CRISPRMAX? Cas9轉染試劑
對于基因組編輯，有些人使用CRISPR
質粒，有些人使用Cas9 mRNA。其實，使用Cas9蛋白可在原代細胞和干細胞中獲得出色的切割效率。它避免了轉錄或翻譯，可立即發(fā)揮作用，快速去除，程度地降低了脫靶剪切的幾率。GeneArt? Platinum? Cas9核酸酶就是這樣一種野生型的Cas9蛋白。
也許你要問，如何將Cas9蛋白導入細胞呢？那就要依靠Lipofectamine? CRISPRMAX? Cas9轉染試劑了。這是款為CRISPR-Cas9蛋白轉染而優(yōu)化的脂質體納米微粒轉染試劑。這款試劑簡單易用，高效低毒，如今已在iPSC、mESC、CHO等20多種細胞上進行了檢驗。與電穿孔相比，它更為溫和，因此所需的細胞較少，每個反應的成本較低。此外，它也能輕松擴展到高通量實驗，是CRISPR實驗的好幫手。
RNAi的不二之選——Lipofectamine? RNAiMAX
RNAi作為基因功能研究的基本工具，如今已應用在蛋白質抑制研究、表型分析、通路分析和藥物靶點發(fā)現(xiàn)上。小分子RNA（siRNA、miRNA）有其自身的特點，也就需要不一般的轉染試劑。
Lipofectamine? RNAiMAX 轉染試劑就是專門為小分子RNA而優(yōu)化的，可以高效地將小分子RNA導入廣泛的細胞系，包括常見的細胞類型、干細胞、原代細胞以及難轉染的細胞。
這種轉染試劑可以在10倍試劑濃度范圍內獲得的干擾效果以及極佳的細胞存活率，這個特點使得Lipofectamine? RNAiMAX的轉染條件極易優(yōu)化，以便在實驗中使用的siRNA濃度，從而降低細胞毒性。盡管Lipofectamine? RNAiMAX的說明書建議以10 nM siRNA 作為優(yōu)化干擾效果的起始濃度，但是僅用1 nM siRNA 也可以獲得較好的干擾效果。
Lipofectamine? RNAiMAX的操作也相當簡單，轉染后無需去除轉染復合物，無需更改或添加
培養(yǎng)基。如果轉染的效果不理想，可以試試反向轉染，或改變siRNA用量，或轉染時的細胞密度。另外，這款試劑只能用于小分子RNA的轉染，不能用于共轉染。如果需要共轉染，只能借助Lipofectamine 3000或2000。
體內轉染不再是難題——Invivofectamine 3.0
眾所周知，原代細胞的轉染比傳代細胞要難得多，而體內轉染又比體外轉染要難。對于這種高難度的實驗，勉強使用傳統(tǒng)的體外轉染試劑（如脂質體）是沒有幸福的，還是用專門的體內轉染試劑，比如Thermo Fisher的Invivofectamine系列。一眨眼，Invivofectamine試劑已經升級到第三代。
Invivofectamine 3.0試劑是一種無動物來源成分的脂質納米顆粒，通過尾部靜脈注射，能夠將siRNA和miRNA高效導入小鼠肝臟細胞。轉染效果如何？專家們做過實驗，將Invivofectamine 3.0試劑與針對Factor VII或PPIB的siRNA混合，以每千克小鼠體重1 mg的注射量進行靜脈注射，*終實現(xiàn)了高達85%的knockdown。與之前的產品相比，新試劑只需更少的siRNA，即可實現(xiàn)有效knockdown。此外，單次注射Invivofectamine 3.0試劑/siRNA復合物后，knockdown效果可維持長達3周。想要靶向其它器官？遠慕的科學家還進行了胰腺和脾臟的實驗，取得了很好的效果。
至于它的體內毒性，專家們也曾評估過。他們在試劑注射后的多個時間點進行血液化學分析及細胞因子檢測。結果表明轉染后每個個體的生物標志物的水平與未注射該試劑的個體相比并沒有顯著差異。這表明復合物表現(xiàn)出極低的體內毒性。這種試劑也相當穩(wěn)定，即使反復凍融4次，也不會造成性能損失。
終極武器——Neon轉染系統(tǒng)
如果這些熱門工具都不管用，那我們只能祭出終極武器——Neon轉染系統(tǒng)。這是Thermo Fisher第二代的臺式電穿孔設備，可將核酸（包括質粒DNA和siRNA）高效導入幾乎任意一種動物細胞內，包括難以轉染的原代細胞、干細胞和造血系統(tǒng)來源的細胞，同時保持高的細胞活性。
與傳統(tǒng)的電穿孔儀不同，Neon系統(tǒng)并沒有傳說中的電轉杯，而是用一個特殊的移液器吸頭取代。移液器吸頭內使用24K鍍金電極，可形成更為均勻的電場，同時限度地減少溫度升高和pH值變化幅度，在確保細胞高效轉染的同時，也更加溫和，保證細胞存活率更高。
Neon系統(tǒng)帶有兩種吸頭：10 μl和100 μl，讓你可根據(jù)實驗要求靈活選擇，而不像傳統(tǒng)電穿孔儀那樣只能轉染固定量的細胞。使用Neon系統(tǒng)，每次*少可轉染2×104個細胞，*多可轉染6×106個細胞。當然，這并非絕對。若你的細胞更少或更多，也可一試，據(jù)專家介紹，有一位用戶曾成功轉染了5000個原代毛囊細胞。
Neon也是一個開放的系統(tǒng)，讓用戶能夠單獨控制每個參數(shù)。廠家也提供了一個數(shù)據(jù)庫，收集各種細胞類型的建議設置，你可在這個基礎上優(yōu)化和調整。Neon能夠對多種難以轉染的細胞進行高效轉染，包括原代星形膠質細胞、原代樹突狀細胞、Jurkat、小鼠胚胎干細胞等。多種細胞類型可獲得超過75%的轉染效率。
客服一
