91精品午夜无码XXXX,一级全黄老妇女裸交淫免费看,日韩丝袜亚卅国产欧美一区韩三级,色Y导航

不論對何種生物而言，DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用（DPI）都是至關(guān)重要的。你想，基因的表達(dá)、復(fù)制、重組和修復(fù)，以及RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯，哪個(gè)離得開這種相互作用？

早在十九世紀(jì)后期，科學(xué)家們就通過顯微鏡觀察到了蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用。自那以后，他們開始深入探索蛋白質(zhì)結(jié)合并控制DNA和RNA的機(jī)制。

總的來說，與DNA結(jié)合的蛋白是普遍存在的，大約占了高等動植物蛋白質(zhì)組的10%，也就是說，各個(gè)物種平均而言約有2000個(gè)。


相互作用可能是特異性的，由核酸序列所控制，并由氫鍵、離子相互作用和范德華力介導(dǎo)。轉(zhuǎn)錄的控制就是一個(gè)例子。不過，也可能是非特異性的，通過蛋白功能基團(tuán)與DNA骨架之間的吸引而發(fā)生。

分析方法

對于大部分的相互作用，人們只是略知皮毛。研究通常從鑒定蛋白質(zhì)組分開始。常用的分析方法包括顯微鏡和經(jīng)典的生化分析，如染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）、指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）、電泳遷移率分析（EMSA）、DNase足跡分析以及蛋白結(jié)合芯片。

ChIP是讓蛋白質(zhì)與其DNA目標(biāo)共價(jià)結(jié)合，之后將它們解交聯(lián)，并分別鑒定。SELEX將目標(biāo)蛋白暴露在寡核苷酸的隨機(jī)文庫中。之后分離出與之結(jié)合的基因并通過PCR擴(kuò)增。DNase I 足跡分析定位蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合位點(diǎn)，然后進(jìn)行有限的DNA消化。芯片則鑒定與標(biāo)記的蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)的基因序列，隨后進(jìn)行熒光檢測。

研究人員也采用各種顯微技術(shù)來探索DNA-蛋白互作，包括光學(xué)、熒光、電子和原子力顯微鏡，后兩者提供了的空間分辨率，不過，電鏡僅限于靜態(tài)觀察，而不能分辨動態(tài)相互作用。

原子力顯微鏡（AFM）可以說是多功能的顯微方法。它利用微懸臂感受和放大懸臂上微小針尖與受測樣品原子之間的作用力，從而達(dá)到檢測目的，具有原子級的分辨率，可探測單分子的分子間作用力。

瑞士洛桑聯(lián)邦理工學(xué)院的科學(xué)家Sandor Kasas指出，高速AFM能夠以極高的分辨率來探索蛋白質(zhì)及相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)。“通過高速AFM，所有相互作用的動力學(xué)都可以被實(shí)時(shí)追蹤，同時(shí)測定蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用力。”

原子力顯微鏡的*新應(yīng)用是將蛋白質(zhì)附著在針尖，然后測定它與自由漂浮的DNA之間的互作。蛋白質(zhì)樣品可以是溶液形式，也可以不是，這具體取決于研究人員要尋找的目標(biāo)。不過，它必須固定在底物上，才能通過顯微鏡觀察。

在快速實(shí)驗(yàn)中，樣品可以在空氣中成像。這種情況下的附著相對比較容易。不過，若要尋找互作動力學(xué)，成像必須在液體中進(jìn)行，這時(shí)附著就比較復(fù)雜。“DNA必須牢固附著在表面，才能被顯微鏡所看見，但又不能太牢固，以便與蛋白質(zhì)相互作用。有時(shí)這挺難實(shí)現(xiàn)的，”Kasas補(bǔ)充說。

當(dāng)然，原子力顯微鏡的價(jià)格不菲。一臺低速顯微鏡的價(jià)格大約在10萬-20萬美元，這意味著許多部門需要合力才能購買一臺。有些機(jī)構(gòu)愿意與生物學(xué)家合作。高速顯微鏡則是另一碼事。“它們目前還很稀少，只有幾個(gè)研究組擁有，法國只有5臺，而美國大概有十幾臺，”Kasas說。不過對于互作研究的前沿科學(xué)家而言，它們是至關(guān)重要的。

不斷改進(jìn)

與任何新興的研究領(lǐng)域一樣，實(shí)驗(yàn)方法必須經(jīng)過千錘百煉，才能不斷改進(jìn)。比如ChIP技術(shù)，目前已衍生出許多替代技術(shù)，Promega公司的HaloCHIP™系統(tǒng)就是其中的一種。

HaloCHIP系統(tǒng)能共價(jià)捕獲細(xì)胞內(nèi)的DNA-蛋白復(fù)合物，而不使用抗體。感興趣的蛋白與組氨酸標(biāo)記的HaloTag融合表達(dá)。隨后在甲醛的作用下與DNA交聯(lián)，并用HaloLink樹脂捕獲。洗掉非特異的蛋白和DNA后，加熱使得融合蛋白與DNA解離，之后進(jìn)行純化和分析。據(jù)介紹，HaloCHIP的整個(gè)過程不到48小時(shí)，步驟更少，但信噪比更高，同時(shí)限度減少了實(shí)驗(yàn)誤差。

HaloCHIP后DNA序列的測定可以通過幾種方式實(shí)現(xiàn)，這取決于您對DNA結(jié)合位點(diǎn)的了解。PCR、qPCR、芯片和測序都是常用的方法。您還需要適當(dāng)?shù)膶φ�，以便了解和定量富集過程。

Promega的資深科學(xué)家Danette Daniels解釋說：“人們對轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳蛋白在全基因組內(nèi)的結(jié)合表現(xiàn)出濃厚的興趣，希望鑒定各種細(xì)胞類型和疾病狀態(tài)下的結(jié)合。”此外，她指出，鑒定蛋白-RNA復(fù)合物，了解這些互作所需的RNA序列特異性，也是一個(gè)激動人心的新方向。

物理鑒定

生化分析只是DNA-蛋白質(zhì)互作研究的一個(gè)方面。X射線晶體衍射等物理方法也提供了寶貴的見解。獲得的晶體結(jié)構(gòu)可揭示復(fù)合物所在的位置，鑒定復(fù)合物中的必需氨基酸殘基。這將有助于下游的藥物開發(fā)，特別是基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)。

然而，常規(guī)的結(jié)晶技術(shù)似乎不適用于互作研究，所得的晶體往往由單獨(dú)的蛋白或DNA組成，造成假陽性。于是，維克森林大學(xué)醫(yī)學(xué)院的生化教授Thomas Hollis采用了一種新穎的方法。他將一種稱為不完全因子設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)開發(fā)技術(shù)與已知的結(jié)晶條件相結(jié)合，帶來蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物晶體篩選。

這個(gè)篩選系統(tǒng)包括48種篩查條件，每種條件使用不同的沉淀劑、緩沖液和鹽組合，并提供1.5 mL的混合物。研究人員可將這些條件放在96孔板中進(jìn)行結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，以鑒定哪種條件有助于結(jié)晶的形成。

不過，篩選只是這個(gè)過程中的步。在確定了晶體形成的條件之后，研究人員必須進(jìn)一步優(yōu)化，以便產(chǎn)生強(qiáng)烈衍射的晶體。這是所有晶體篩選的限制。