WB 條帶大小和蛋白預(yù)測八字不合？先檢查這 5 點(diǎn)！_新聞中心

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WB 條帶大小和蛋白預(yù)測八字不合？先檢查這 5 點(diǎn)！
閱讀次數(shù)：906 發(fā)布時(shí)間：2019/3/7 14:06:00

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WB 實(shí)驗(yàn)是各位童鞋們，時(shí)常光顧的一個(gè)實(shí)驗(yàn)。但就是這樣一個(gè)初級(jí)又常用的實(shí)驗(yàn)，卻會(huì)出現(xiàn)各種稀奇古怪的問題。

比如在 WB 實(shí)驗(yàn)鑒定蛋白時(shí)，我們得到的蛋白質(zhì)條帶大小常常會(huì)和預(yù)測值有所偏差。

這下面的 5 條準(zhǔn)則，在遇到蛋白質(zhì)條帶大小和預(yù)測值偏差的時(shí)候，拿出來分析一下。

我們可以對(duì)照著這張圖來看原因。

下面就來詳細(xì)地講解一下這 5 條具體是個(gè)啥。

當(dāng)我們做 WB 實(shí)驗(yàn)鑒定蛋白的時(shí)候，*喜歡看到的是這樣的條帶：

但通常，自己做出來的，就會(huì)變成這樣：

是生活對(duì)我們這些實(shí)驗(yàn)小可愛下手了嗎？
還是水逆沒過去？
為什么 WB 跑了這么多次，
都和預(yù)測差了這么多？

當(dāng)然不是那些玄學(xué)流原因啦。讓我們科學(xué)地分析一下到底是哪里出了問題。

▪內(nèi)源性蛋白 or 重組蛋白

查問題要從源頭查起，所以各位艾粉們要先看一看樣品是內(nèi)源性蛋白還是重組蛋白？

如果是內(nèi)源性蛋白還不打緊，如果是重組蛋白，那么馬上就要看一看重組蛋白是否為全長序列了。假如樣品是重組蛋白，還不是全長序列，那么條帶大小一定會(huì)和預(yù)測大小不一致。

▪多個(gè) isoform 辨仔細(xì)

如果確定了樣品是內(nèi)源蛋白，那就要看看我們的目標(biāo)蛋白是不是有其他的 isoform，這個(gè)我們通常會(huì)去查看 NCBI 或者 SWISSPROT 來確認(rèn)。

▲ SWISSPROT 會(huì)標(biāo)出有些基因有多種 isoform

做著實(shí)驗(yàn)，結(jié)果換了別的 isoform 可就一頓瞎忙活啦。

▪剪切活化要注意

如果在 SWISSPROT 或者權(quán)威的文獻(xiàn)里提到了，樣品的這個(gè)蛋白需要剪切活化，那么結(jié)果又要和預(yù)測值不同啦。

▪成倍增長多聚體

如果蛋白大小和預(yù)測值有明顯倍數(shù)關(guān)系，那就要考慮一下這個(gè)蛋白是不是二聚體或者多聚體啦。

▪蛋白修飾要變大

如果排除了以上 4 條原因，預(yù)測值和實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，那就是因?yàn)槲覀兠鎸?duì)的蛋白質(zhì)，是個(gè)善變的對(duì)象，它不僅會(huì)剪切活化，還有在翻譯表達(dá)后修飾。

比如：比如甲基化、乙�；⒘姿峄�、糖基化、烷基化、生物素化、谷氨酸化、甘氨酸化、硫酸化、異.戊二烯化、硫辛酸化、磷酸泛酰巰基乙.胺基化……balabala。

在不同狀態(tài)下的蛋白質(zhì)還會(huì)有不同的修飾。加入了官能團(tuán)肯定會(huì)讓蛋白質(zhì)比預(yù)測值偏大。在日常的實(shí)驗(yàn)中，糖基化是比較常見的修飾，一般會(huì)導(dǎo)致跑出來的條帶比預(yù)測值大那么一些。