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一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

1、學(xué)習(xí)紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理；

2、掌握紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)；

3、掌握UV-1700PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的使用方法并了解此儀器的主要構(gòu)造。

二、實(shí)驗(yàn)原理

紫外-可見(jiàn)吸收光譜法又稱(chēng)紫外-可見(jiàn)分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜，是以溶液中物質(zhì)分子對(duì)光的選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來(lái)的一類(lèi)分析方法。紫外-可見(jiàn)吸收光譜的產(chǎn)生是由于分子的外層價(jià)電子躍遷的結(jié)果，其吸收光譜為分子光譜，是帶光譜。

進(jìn)行定性:利用紫外-可見(jiàn)吸收光譜法進(jìn)行定性分析一般采用光譜比較法。即將未知純化合物的吸收光譜特征，如吸收峰的數(shù)目、位置、相對(duì)強(qiáng)度以及吸收峰的形狀與已知純化合物的吸收光譜進(jìn)行比較。

定量分析:紫外-可見(jiàn)吸收光譜法進(jìn)行定量分析的依據(jù)是朗伯-比爾定律：A=lgI0/I=εbc，當(dāng)入射光波長(zhǎng)λ及光程b一定時(shí)，在一定濃度范圍內(nèi)，有色物質(zhì)的吸光度A與該物質(zhì)的濃度c成正比，即物質(zhì)在一定波長(zhǎng)處的吸光度與它的濃度成線(xiàn)形關(guān)系。因此，通過(guò)測(cè)定溶液對(duì)一定波長(zhǎng)入射光的吸光度，就可求出溶液中物質(zhì)濃度和含量。由于大吸收波長(zhǎng)λmax處的摩爾吸收系數(shù)大，通常都是測(cè)量λmax的吸光度，以獲得大靈敏度。

光度分析時(shí)，分別將空白溶液和待測(cè)溶液裝入厚度為b的兩個(gè)吸收池中，讓一束一定波長(zhǎng)的平行單色光非別照射空白和待測(cè)溶液，以通過(guò)空白溶液的透光強(qiáng)度為I0，通過(guò)待測(cè)溶液的透光強(qiáng)度為I，根據(jù)上式，由儀器直接給出I0與I之比的對(duì)數(shù)值即吸光度。

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì):紫外-可見(jiàn)吸收光譜法所采用的儀器稱(chēng)為分光光度計(jì)，它的主要部件有五個(gè)部分組成，即：光源;單色器;吸收池;檢測(cè)器;信號(hào)顯示器。

由光源發(fā)出的復(fù)合光經(jīng)過(guò)單色器分光后即可獲得任一所需波長(zhǎng)的平行單色光,該單色光通過(guò)樣品池靜樣品溶液吸收后，通過(guò)光照到光電管或光電倍增管等檢測(cè)器上產(chǎn)生光電流，產(chǎn)生的光電流由信號(hào)顯示器直接讀出吸光度A�？梢�(jiàn)光區(qū)采用鎢燈光源、玻璃吸收池；紫外光區(qū)采用氘燈光源、石英吸收池。

本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)原理：

（1）蛋白質(zhì)可作定量分析的原因：蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質(zhì)溶液在275 280nm具有一個(gè)吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在大吸收波長(zhǎng)處的吸光度與其濃度成正比，服從朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。該法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度范圍為0.1—1.0mg/mL。

（2）此種方法測(cè)量的準(zhǔn)確度差一點(diǎn)的原因：由于不同蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所處的微環(huán)境也不同，所以不同蛋白質(zhì)溶液在280nm的光吸收職也不同。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，濃度為1.0 mg/mL的1800種蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)亞基在280nm的吸光度在0.3—3.0之間，平均值為1.25+/-0.51。所以此種方法測(cè)量的準(zhǔn)確度差一點(diǎn)。

（3）有嘌呤、嘧啶等核酸類(lèi)干擾時(shí)的經(jīng)驗(yàn)公式：若樣品中含有嘌呤、嘧啶等核酸類(lèi)吸收紫外光的物質(zhì)，在280nm處來(lái)測(cè)量蛋白質(zhì)含量時(shí)，會(huì)有較大的干擾。核酸在260nm處的光吸收比280nm更強(qiáng)，但蛋白質(zhì)卻恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。常用下列經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：

蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260(A280和A260分別為蛋白質(zhì)溶液在280nm和260nm處測(cè)得的吸光度值)

還可以通過(guò)下述經(jīng)驗(yàn)公式直接計(jì)算出溶液中的蛋白質(zhì)的含量：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=F*A280*D*1/d

其中A280為蛋白質(zhì)溶液在280nm處測(cè)得的吸光度值；d為石英比色皿的厚度（cm）；D為溶液的稀釋倍數(shù)；F為校正因子

（4）稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的經(jīng)驗(yàn)公式：蛋白質(zhì)的肽鍵在200—250nm有強(qiáng)的紫外吸收。其光吸收強(qiáng)度在一定范圍與濃度成正比，其波長(zhǎng)越短，光吸收越強(qiáng)。若選用215nm可減少干擾及光散射，用215nm和225nm光吸收差值與單一波長(zhǎng)測(cè)定相比，可減少非蛋白質(zhì)成分引起的誤差，因此，對(duì)稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，可選用215nm和225nm光吸收差法。常用下列經(jīng)驗(yàn)公式：

蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=0.144（A215-A225）

（A215和A225分別為蛋白質(zhì)溶液在215nm和225nm處測(cè)得的吸光度值）

三、儀器與試劑

儀器：UV-1700PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，比色管（10ml的5個(gè)），吸量管。

試劑：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：3.00 mg/mL溶液、0.9%NaCl溶液，待測(cè)蛋白質(zhì)溶液。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

〈一〉準(zhǔn)備工作

1．啟動(dòng)計(jì)算機(jī)，打開(kāi)主機(jī)電源開(kāi)關(guān)，啟動(dòng)工作站并初始化儀器。

2.在工作界面上選擇測(cè)量項(xiàng)目（光譜掃描，光度測(cè)量），本實(shí)驗(yàn)選擇光度測(cè)量，設(shè)置測(cè)量條件（測(cè)量波長(zhǎng)等）。

3.將空白放入測(cè)量池中，點(diǎn)擊START掃描空白，點(diǎn)擊ZERO校零。

4.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作。

〈二〉測(cè)量工作

1.吸收曲線(xiàn)的繪制:用吸量管吸取2mL3.00mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用25px石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在190 nm～400nm區(qū)間，測(cè)量吸光度。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：用吸量管分別吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL 3.00 mg.mL-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于5只10 mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在280 nm處分別測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A278記錄所得讀數(shù)。

3.樣品測(cè)定：取適量濃度的待測(cè)蛋白質(zhì)溶液3 mL，用0.9%NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻，按上述方法測(cè)定278nm處的吸光度。平行測(cè)定三份。

五、數(shù)據(jù)處理：

1.以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸收曲線(xiàn)，找出大吸收波長(zhǎng)。由吸收曲線(xiàn)可得大吸收波長(zhǎng)λmax=278nm

2.以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

平均濃度=0.641088 mg/mL

SD=0.009434

RSD=1.4715%

當(dāng)置信度為P=95%時(shí),f=2,t0.95,2=4.3

在誤差允許的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的含量為0.641088mg/mL

原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司