ELISA實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)曲不僅能夠幫助我們計(jì)算出樣本濃度，還是指示實(shí)驗(yàn)人員操作手法是否規(guī)范的重要標(biāo)志。在ELISA實(shí)驗(yàn)過程中，往往有標(biāo)曲異常的情況出現(xiàn)，下面，遠(yuǎn)慕將介紹幾種特殊情況，并將其原因與對策一一道來。
1.整體偏低
雖然標(biāo)曲有一定梯度，但是/大OD值<1.2，梯度沒有拉開。
可能原因：
1) 試劑盒過期或保存不當(dāng)；
2) 標(biāo)準(zhǔn)品未溶解完/全；
3) 加入終止液后，沒有立即檢測；
4) 試劑盒部分試劑（特別是洗滌液）混用其他批次，或?yàn)榛煊猛庠慈軇?br />
建議：
1) 按照說明書保存各組分，在保質(zhì)期內(nèi)使用；
2) 標(biāo)準(zhǔn)品溶解，需要離心處理(10000×g離心1分鐘)，加入1.0mL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液后，靜置1-2分鐘，用低速渦旋儀充分混勻；
3) 加入終止液后，請立即進(jìn)行檢測。若需等待，放置在避光處的時(shí)間不宜超過10分鐘；
4) 使用試劑盒內(nèi)一套完整的試劑，不要混用其他批次或外源溶劑。
2.無信號
標(biāo)曲沒有顯色，OD值無梯度變化。
可能原因：
1) 試劑盒過期，或保存不當(dāng)；
2) HRP酶受到污染，導(dǎo)致活力和效價(jià)降低；
3) 實(shí)驗(yàn)操作失誤。例如：將生物素化
抗體工作液和酶結(jié)合工作液的加樣順序顛倒；
4) 訂購多個(gè)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)時(shí)混用標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)板、生物素化抗體等。
建議：
為了快速排查原因，請嘗試混合10μL底物溶液和2μL濃縮HRP酶，觀察是否發(fā)生顏色變化，并及時(shí)對顯色結(jié)果拍照。
如果有顏色變化（混用后呈現(xiàn)深藍(lán)色/藍(lán)綠色），表明HRP酶和TMB并無污染問題，可重新取一條板條，在避免以上問題的情況下制作標(biāo)曲。
3.整體偏高
酶標(biāo)儀儀器光密度范圍過廣，導(dǎo)致檢測OD值范圍也很高。建議光密度范圍設(shè)置在0-3.5之間。
可能原因：
部分OD值超出儀器檢測范圍，可能是由于工作液濃度過高，或孵育時(shí)間過長/溫度過高。
建議：
1) 按照說明書要求，在工作液使用15分鐘，將濃縮液于800×g離心1分鐘，以濃縮液：稀釋液=1：99的比例，現(xiàn)配現(xiàn)用；
2) 孵育箱或烘箱需控制溫度恒定37℃，溫差不超過1℃，底物反應(yīng)時(shí)間為15分鐘左右。建議根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔4孔出現(xiàn)明顯藍(lán)色梯度，來控制實(shí)際顯色時(shí)間，顯色時(shí)間酌情縮短或延長，但不可超過30分鐘。
4.全陽性
可能原因：
1) 競爭法按照夾心法操作；
2) 洗滌不當(dāng)：洗滌時(shí)每孔注入的洗液不夠，或洗滌次數(shù)不夠；液體過多溢出污染；浸泡時(shí)間過短；
3) 顯色劑保存不當(dāng)，孵育時(shí)未避光，或試劑被污染等，造成非特異性顯色。
建議：
1) 夾心法和競爭法原理不同，操作步驟不同，請注意區(qū)分；
2) 按照說明書中洗滌操作進(jìn)行洗滌；
3) 避光保存底物溶液，使用再拿出，避光孵育；各類試劑現(xiàn)用現(xiàn)拿，現(xiàn)配現(xiàn)用，注意槍頭和加樣槽的潔凈，避免試劑污染。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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