PCR擴(kuò)增過(guò)程中，每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度。隨著反應(yīng)循環(huán)次數(shù)的不斷增加，所擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長(zhǎng)，反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正比。儀器實(shí)時(shí)檢測(cè)和采集的熒光信號(hào)，隨著時(shí)間和循環(huán)數(shù)的不斷增加，產(chǎn)生一條反映實(shí)時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度變化的曲線，稱為擴(kuò)增曲線。擴(kuò)增曲線以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)。
異常狀態(tài)擴(kuò)增曲線1、擴(kuò)增曲線抬升，與閾值線相交產(chǎn)生了CT值
原因分析
① 軟件在進(jìn)行基線自動(dòng)扣除的時(shí)候出現(xiàn)錯(cuò)誤，引起了擴(kuò)增曲線抬升；
② 選用的耗材、試劑或者操作的原因，導(dǎo)致背景熒光信號(hào)有所波動(dòng)，造成反應(yīng)孔的自動(dòng)基線扣除錯(cuò)誤；
③ 探針濃度過(guò)高，體系中有熒光物質(zhì)污染，擴(kuò)增效率低。
解決方案
① 采取手動(dòng)調(diào)整基線的方法，重新定義基線即可正常（即將基線起點(diǎn)改為熒光信號(hào)穩(wěn)定的循環(huán)數(shù)，基線終點(diǎn)設(shè)置成擴(kuò)增曲線起峰的一個(gè)循環(huán)數(shù)）；
② 重新提取樣本、重新配置試劑（可采用不同廠家試劑檢測(cè)），注意人員操作；
③ 稀釋模板重新擴(kuò)增。
2、擴(kuò)增曲線不平整，有向上或者向下的尖峰
原因分析
① 儀器不穩(wěn)定導(dǎo)致的擴(kuò)增曲線異常（也可能突然停電或者電壓不穩(wěn)）；
② 尖峰向下，可能是鹵素?zé)衾匣掳l(fā)射光源不穩(wěn)定（指鹵鎢燈光源的激發(fā)器）；
③ 尖峰向上，考慮儀器或者孔位問(wèn)題，還要考慮反應(yīng)體系是否存有氣泡。
解決方案
① 檢查儀器性能，檢查實(shí)驗(yàn)室電壓情況；
② 定期儀器保養(yǎng)維修，避免配件老化問(wèn)題出現(xiàn)；
③ 檢查問(wèn)題孔位，排除孔位問(wèn)題；
④ 配制反應(yīng)體系，分裝避免產(chǎn)生大量氣泡，模板加完，微孔板離心再擴(kuò)增。
3、擴(kuò)增曲線末尾起跳
原因分析
① 陰性對(duì)照曲線末尾起跳，表示存在交叉污染；
② 復(fù)檢樣本，排除非特異性擴(kuò)增的可能性；
③ 正常樣本曲線末尾起跳，懷疑模板存在交叉污染；或者樣本濃度低、加樣量不準(zhǔn)確導(dǎo)致擴(kuò)增效率低；
④ 所用的試劑設(shè)計(jì)不合理，或存在交叉污染，或操作環(huán)境中有氣溶膠造成污染。
解決方案
① 檢查陰性對(duì)照是否存在污染；
② 復(fù)檢樣本，如果復(fù)檢后曲線為陰性直線則說(shuō)明之的末尾起跳為非特異性擴(kuò)增，如果復(fù)檢后曲線與樣末尾起跳則表示該樣本中待檢病毒核酸的濃度偏低；
③ 更換試劑，建議使用不同廠家試劑比對(duì)；
④ 對(duì)操作環(huán)境進(jìn)行處理或更換新的環(huán)境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。
4 、擴(kuò)增曲線分布混亂
原因分析
熒光波長(zhǎng)范圍存在重疊，影響PCR檢測(cè)通路采集熒光信號(hào)。
解決方案
進(jìn)行熒光補(bǔ)償，再分析可正常。
5、擴(kuò)增曲線擴(kuò)增不完整
原因分析
① 模板污染導(dǎo)致降解，或者樣本濃度低、加樣量不準(zhǔn)確導(dǎo)致擴(kuò)增效率低；
② 模板濃度太高，或者存在抑制成分；
③ 熒光染料濃度低，或者儀器問(wèn)題熒光收集異常；
④ Taq酶無(wú)活性或活性降低；
⑤ 試劑配制沒(méi)充分混勻，分裝不均勻。
解決方案
① 重新提取樣本，排除提取效率變低、加樣量不足等因素；
② 稀釋模板，重新擴(kuò)增；
③ 檢查試劑，更換新試劑，雙試劑檢測(cè)；
④ 試劑配制充分混勻，分裝準(zhǔn)確；
⑤ 檢查儀器。
6、擴(kuò)增曲線壓低
原因分析
① 模板濃度太高；
② 試劑問(wèn)題，限制PCR反應(yīng)速率和性能。
解決方案
① 稀釋模板，重新擴(kuò)增；
② 檢查試劑，更換新試劑，雙試劑檢測(cè)。
7、擴(kuò)增曲線邊下降，后邊正常
原因分析
PCR期過(guò)程中，試劑和模板沒(méi)有得到充分的混勻，導(dǎo)致信號(hào)的不穩(wěn)定，反應(yīng)幾個(gè)循環(huán)之后，模板和反應(yīng)液開(kāi)始混勻，熒光信號(hào)就變得穩(wěn)定。
8、內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線未起
原因分析
① 試劑配制沒(méi)充分混勻，分裝不均勻，有效成分低；
② 模板提取失敗，或者污染降解；
③ 采樣不準(zhǔn)，沒(méi)有樣本。
解決方案
① 檢查試劑，更換新試劑，雙試劑檢測(cè)；試劑配制充分混勻，分裝準(zhǔn)確；
② 重新提取樣本；
③ 重新采樣檢測(cè)。
9、標(biāo)準(zhǔn)曲線異常，線性關(guān)系不佳R2<0.9
原因分析
① 標(biāo)準(zhǔn)品加樣誤差，標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解；
② 模板中存在抑制物；
③ 試劑缺陷，引物或探針不佳，重新設(shè)計(jì)。
解決方案
① 充分混勻標(biāo)準(zhǔn)品；
② 使用新的標(biāo)準(zhǔn)品；
③ 檢查耗材，更換試劑，避免環(huán)境存在抑制物。
10、擴(kuò)增曲線變形
原因分析
① PCR反應(yīng)板封膜不嚴(yán)或質(zhì)量不好，在PCR過(guò)程中受到水蒸氣的影響；
② 反應(yīng)體系或模板存在抑制物。
解決方案
① PCR反應(yīng)板封膜壓實(shí)，選擇配套耗材，有瑕疵的及時(shí)更換；
② 重新提取，重新配制試劑再檢測(cè)；
③ 復(fù)檢樣本。
11、擴(kuò)增曲線不平，與基線相切
原因分析
① 10個(gè)循環(huán)左右開(kāi)始有抬高趨勢(shì)，一般15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，此時(shí)反應(yīng)體系和模板處于不穩(wěn)定狀態(tài)；
② 基線自動(dòng)扣除的時(shí)候出現(xiàn)錯(cuò)誤，引起了擴(kuò)增曲線抬升；
③ 反應(yīng)體系不均一，干擾熒光信號(hào)采集。
12、擴(kuò)增曲線先抬高再降低
原因分析
嚴(yán)重的蒸發(fā)會(huì)呈現(xiàn)先上升后下降的曲線，輕微的蒸發(fā)會(huì)是一種緩慢的上升，這類異常曲線可檢查檢測(cè)后的反應(yīng)管液面是否有下降的現(xiàn)象來(lái)證明。
解決方案
上機(jī)檢測(cè)檢查96微孔板封膜完好，保/證無(wú)縫隙后上機(jī)擴(kuò)增。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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