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（）試劑準備

1．TRIzol試劑。

2．氯-仿

3．異-丙醇

4．75%乙醇（DEPC H2O配制）

5．DEPC H2O

（二）操作步驟

1． 樣品處理：

（1）培養(yǎng)細胞：收獲細胞1-5×107，移入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol，混勻，室溫靜置5min。

（2）組織：取50-100mg組織（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置1.5ml離心管中，加入1ml Trizol充分勻漿，室溫靜置５min。

2．加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。

3．4℃離心，12000g×15min，取上清。

4．加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。

5．4℃離心，12000g×10min，棄上清。

6．加入1ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃，7500g×5min，棄上清。

7. 晾干，加入適量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。

（三）注意事項

1．樣品量和Trizol的加入量定要按步驟（1）的比例，不能隨意增加樣品量或減少Trizol量，否則會使內(nèi)源性RNase的抑制不完全，導(dǎo)致RNA降解。

2．實驗過程必須嚴格防止RNsae的污染。

總RNA定量

RNA定量方法與DNA定量相似。RNA在260nm波長處有大的吸收峰。因此，可以用260nm波長分光測定RNA濃度，OD值為1相當于大約40μg/ml的單鏈RNA。如用1cm光徑，用 ddH2O稀釋DNA樣品n倍并以ddH2O為空白對照，根據(jù)此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋的濃度：

RNA（mg/ml）=40×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)(n)/1000

RNA純品的OD260/OD280的比值為2.0，故根據(jù)OD260/OD280的比值可以估計RNA的純度。若比值較低，說明有殘余蛋白質(zhì)存在；比值太高，則提示RNA有降解。

原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司