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管碟法是國(guó)內(nèi)外常用的抗生素微生物檢定法，利用管碟法測(cè)定抗生素效價(jià)，具有準(zhǔn)確、直觀、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛采用。但是整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中影響結(jié)果的因素很多，任何一個(gè)環(huán)節(jié)操作不當(dāng)或者忽略就會(huì)造成很大誤差，導(dǎo)致整組試驗(yàn)失敗。其中，芽孢懸液的制備就有很多需要注意的地方。

在用管碟法檢定抗生素時(shí)，需要將菌懸液與培養(yǎng)基混合均勻、覆蓋在底層培養(yǎng)基上，以形成抑菌圈。其中，對(duì)于菌懸液的制備要求為：

將所用菌的斜面培養(yǎng)物用 1～2 ml 滅菌水洗下，形成菌懸液;將菌懸液在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上均勻涂布，置于 35～37℃ 條件下培養(yǎng) 7 天;涂片、染色，鏡檢芽孢率 ≥ 85% 時(shí)，用 10 ml 滅菌水將芽孢和菌體的混合物洗下，制成懸液;65℃ 水浴加熱 30 min，殺死菌體，形成有活性的芽孢懸液;冷卻、冰箱中保存?zhèn)溆谩?br /> 

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根據(jù)實(shí)際操作中的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)這一環(huán)節(jié)需要注意的事項(xiàng)總結(jié)如下：

1 應(yīng)該嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作，將涂好的平皿連續(xù)培養(yǎng) 7 天再洗脫芽孢，這樣也有助于芽孢懸液的均一性，避免由于操作標(biāo)準(zhǔn)不一造成的試驗(yàn)結(jié)果的偏差。有文章報(bào)道，將平板培養(yǎng)至 2、3、4、5、6 天與培養(yǎng)至第七天，制成的懸液在抗生素效價(jià)測(cè)定中無(wú)差異;但本人在實(shí)際試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng) 3 天的短小芽孢菌，鏡檢時(shí)芽孢率<80%, 并且平皿一旦從培養(yǎng)箱中拿出來(lái)，室溫放置至第 10 天，芽孢率也不會(huì)再發(fā)生明顯變化，這顯然不符合《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的芽孢率 ≥ 85% 的要求。

2 試驗(yàn)菌的菌齡對(duì)抑菌圈有一定影響。故檢定時(shí)應(yīng)保持菌種及菌液的新鮮。一般菌種一月轉(zhuǎn)種一次，冰箱冷藏保存。對(duì)易變異的菌株，如藤黃微球菌等在制備菌懸液前進(jìn)行單菌分離;其他菌株可半年分離一次。

3 試驗(yàn)菌傳代*-好不超過(guò) 5 次，以防止菌種老化變異。芽孢桿菌培養(yǎng)物用滅菌水洗下后，應(yīng)在 65℃ 加熱 30 分鐘，使菌體的菌齡一致(有資料顯示可 70～75℃ 水浴 30 min 殺死菌體)。

4 加入菌懸液的體積，一般不少于 0.3 ml，并且不大于上層培養(yǎng)基體積的 1%(有資料說(shuō)不大于 2%)。如果加入菌懸液的體積過(guò)小，則在同次實(shí)驗(yàn)中，不同次加入菌懸液的體積相差較大， 造成實(shí)驗(yàn)誤差;如果加入菌懸液的體積過(guò)大，則會(huì)使上層培養(yǎng)基變稀，并且因菌懸液的溫度較低，加至培養(yǎng)基中可能造成培養(yǎng)基結(jié)塊，影響測(cè)定結(jié)果。對(duì)于加入菌懸液體積的控制，可通過(guò)調(diào)節(jié)菌懸液的濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)。

原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司