實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是基于PCR的革命性方法，這一技術(shù)是PCR高靈敏度和實(shí)時(shí)檢測(cè)相結(jié)合的結(jié)果。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)的獨(dú)特特征就是把目的基因的擴(kuò)增與熒光信號(hào)聯(lián)系起來(lái)，并將其量化。 在定量基因表達(dá)分析,目前有兩種方法*受歡迎, SYBR Green ａnd TaqMan，那么這兩種哪個(gè)更好呢？本文分別分析其優(yōu)缺點(diǎn)。
一、熒光染料法(SYBR Green)
其原理是：在PCR反應(yīng)體系中加入過(guò)量熒光染料，DNA擴(kuò)增的過(guò)程中，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈，發(fā)射熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，并且可以實(shí)時(shí)測(cè)量。如果你要擴(kuò)增你的目標(biāo)樣品40個(gè)循環(huán)，在*后一個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測(cè)到的熒光會(huì)比在第10個(gè)循環(huán)測(cè)得的熒光強(qiáng)很多。
優(yōu)點(diǎn)：
成本較低，適合大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)。
在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)階段非常省時(shí)，因?yàn)樗恍枰线m的引物設(shè)計(jì)。
缺點(diǎn)：
特異性不是很高。染料可以插入任何雙鏈DNA，包括引物二聚物和非特異性產(chǎn)物。
如果引物二聚體存在或者產(chǎn)物受到污染，得到的結(jié)果會(huì)不可靠。
更容易與低豐度的目標(biāo)產(chǎn)生非特異性熒光。
需要更多的時(shí)間進(jìn)行結(jié)果分析。
二、寡核苷酸探針(Taqman)
這種方法涉及使用熒光標(biāo)記的寡核苷酸(短DNA分子)，探針通常在5 ＇端和3 ＇端都被標(biāo)記。
在探針的5’端有報(bào)告基團(tuán)，3’端設(shè)計(jì)淬滅基團(tuán)，當(dāng)報(bào)告基團(tuán)接近淬滅基團(tuán)時(shí)，不會(huì)檢測(cè)到熒光信號(hào)。RT-qPCR反應(yīng)時(shí)，寡核苷酸兩個(gè)基團(tuán)分離，即可檢測(cè)到熒光信號(hào)，并與PCR產(chǎn)物同步。
使用這種方法的熒光檢測(cè)依賴(lài)于兩個(gè)過(guò)程:1)引物與目標(biāo)序列的結(jié)合(2)探針與引物下游
互補(bǔ)序列的結(jié)合。
優(yōu)點(diǎn)：
更有可能只放大所需的產(chǎn)物，由于引物和探針的結(jié)合具有特異性。
不需要解離曲線，只有探針與正確的目的序列結(jié)合時(shí)才能檢測(cè)到熒光。
由于具有特異性，數(shù)據(jù)更可靠。
數(shù)據(jù)分析時(shí)節(jié)省時(shí)間。
缺點(diǎn)：
需要大規(guī)模實(shí)驗(yàn)時(shí)耗費(fèi)成本高。
需要更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樾枰玫囊锖吞结槨?br />
總的來(lái)說(shuō)，這兩種熒光檢測(cè)方法都很有效，但對(duì)于你的具體實(shí)驗(yàn)，可以選擇適合的方法。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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